Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος: ένα σημαντικό πεδίο βιοϊατρικής έρευνας

Γράφει ο/η Κωσταντίνος Καλαφατάκης

Η εξέλιξη των τεχνικών της μικροσκοπικής μελέτης των ιστών σε συνδιασμό με την επιτελούμενη πρόοδο των εφαρμογών της μοριακής βιολογίας, συντελεί στην ολοένα και ευκρινέστερη κατανόηση και διάκριση των διαφόρων μορφών κυτταρικού θανάτου. Μία από αυτές, ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (ΠΚΘ), συσχετίζεται πλέον με συγκεκριμένες φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες του ανθρώπου, ενώ παράλληλα δοκιμάζονται και πειραματικά θεραπευτικά σχήματα με στόχο την σε μοριακό επίπεδο αναστολή ή διέγερσή της. Με την πάροδο του χρόνου, τα συμπεράσματα πολλών ερευνητικών πρωτοκόλλων ισχυροποιούν την άποψη πως ο ΠΚΘ συνιστά μιά θεμελιώδη ιστική διεργασία – κοινό τόπο κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και της ιστικής διαφοροποίησης, αλλά εξίσου σημαντική και ως παθοφυσιολογικό υπόβαθρο νευρολογικών ή άλλων παθήσεων. Στη βασική λειτουργική διάκριση του κυτταρικού θανάτου περιλαμβάνονται ο ΠΚΘ και η νέκρωση. Οι δύο αυτές καταστάσεις διέπονται από ιδιαίτερα μικροσκοπικά χαρακτηριστικά, ενώ εξυπηρετούν συγκεκριμένες φυσιολογικές λειτουργίες ή παθολογικούς μηχανισμούς (Πινακάς 1). Ο ΠΚΘ περιλαμβάνει με τη σειρά του μερικές παραλλαγές (απόπτωση, αυτοφαγία κ.α.), οι οποίες διαφοροποιούνται κυρίως στις υποκυτταρικές ακολουθίες πρόκλησης του θανάτου και δευτερευόντως σε ορισμένα μορφολογικά στοιχεία. Πρέπει να τονιστεί, πως η νέκρωση αποτελεί συνώνυμο υποκείμενης παθολογίας, ενώ ο ΠΚΘ απαντάται και σε φυσιολογικές καταστάσεις. ΠΚΘ ΝΕΚΡΩΣΗ  Κυτταρικός θάνατος που διαμεσολαβείται από τη ρύθμιση σειράς γονιδίων, και διέπει φυσιολογικές & παθολογικές καταστάσεις  Μη φυσιολογικός κυτταρικός θάνατος που διαμεσολαβείται από την επίδραση εξωτερικών παραγόντων - ερεθισμάτων Προσβάλλει μεμονωμένα κύτταρα Πυρηνική πύκνωση Συμπύκνωση κυτταροπλάσματος Συσσώρευση κυτταροπλάσματος σε κυστιδικούς σχηματισμούς Συρρίκνωση κυτταρικού μεγέθου Σχηματισμός αποπτωτικών σωματίων με περιεχόμενο ακέραιους οργανιδιακούς σχηματισμού Πυρηνική διάσπαση με άθικτη πυρηνική μεμβράνη Φαγοκυττάρωση αποπτωτικών σωματίων σε απούσα φλεγμονώδη απόκριση Προσβάλλει ομάδες κυττάρων Εξαφάνιση κυτταρικού πυρήνα Εξοιδημένα οργανίδια (π.χ. μιτοχόνδρια) Διαταραχές κυτταρικής μεμβράνης Αποδόμηση μεμβρανών και οργανιδίων Φλεγμονώδης απόκριση   Πίνακας 1 Σημαντικές πληροφορίες για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που απαρτίζουν το φαινόμενο του ΠΚΘ, αλλά και των πιθανών νόσων στις οποίες λαμβάνει χώρα, εξάγονται τόσο από in vitro όσο και από in vivo ερευνητικές μελέτες. Στις πρώτες, χρησιμοποιούνται ειδικοί μοριακοί ανιχνευτές, καθώς και τεχνικές ανοσοφθορισμού ή ανοσοχρωστικής μικροσκόπησης, ανάλυσης ανοσο-στυπώματος, κυτταρομετρίας ροής, και η δοκιμασία ΤUNEL, με στόχο τον εντοπισμό και την ποσοτική ανάλυση ενζυμικών συνιστωσών αυτής της κυτταρικής μορφής θανάτου. Στις δεύτερες, σημαντική συμβολή φέρουν τα διαγονιδιακά ζώα ή ζώα με αυτόματες μεταλλάξεις στην κατανόηση της φυσιολογίας και παθοφυσιολογίας του φαινομένου του ΠΚΘ , αλλά και στην ανίχνευση εμπλεκόμενων πρωτεϊνών (Πίνακας 2). Εξάλλου τα ζωικά μοντέλα συγκροτούν μία εξαιρετική πηγή μελέτης των συσχετίσεων μεταξύ του ΠΚΘ και της νοσολογίας. ΙΝ VITRO ΜΕΛΕΤΕΣ IN VIVO ΜΕΛΕΤΕΣ ΟΝΟΜΑ ΣΤΟΧΟΣ ΟΝΟΜΑ ΣΤΟΧΟΣ Μιτοχονδριακός δείκτης MnSOD  & μικροσκόπηση ανοσοφθορισμού Προσδιορισμός ενδοκυτταρικής θέσης κυτοχρώματος c Διαγονιδιακά ποντίκια Μελέτη συμβολής ΠΚΘ σε διαταραχες του νευρικού συστήματος. Μελέτη γονιδίων που εμπλέκονται στον ΠΚΘ Ανάλυση ανοσοστυπώματος Προσδιορισμός ενεργού μορφής κασπάσης – 3 Φυσιολογικά ποντίκια  Μελέτη συμβολής ΠΚΘ στη διαφοροποίηση του νευρικού συστήματος Κυτταρομετρία ροής Προσδιορισμός φυσικών, βιοχημικών, ανοσολογικών & λειτουργικών κυτταρικών χαρακτηριστικών Ζώα με αυτόματες μεταλλάξεις  Μελέτη γονιδίων που εμπλέκονται στον ΠΚΘ Δοκιμασία TUNEL Προσδιορισμός ακεραιότητας κυτταρικού DNA Σκύλοι με υποκείμενη νευρολογική νόσο Μελέτη παθοφυσιολογίας νόσου & συσχετίσεων νόσου – ΠΚΘ ΠΙΝΑΚΑΣ 2 Ένας αρκετά μεγάλος αριθμός γονιδίων συμμετέχει άμεσα ή έμμεσα στη διαδικασία του ΠΚΘ, γεγονός που υποδηλώνει την ποικιλία ερεθισμάτων, υπό την επίδραση των οποίων ένα κύτταρο μπορεί να οδηγηθεί σε ΠΚΘ, αλλά και την ποικιλία μηχανισμών που πυροδοτούνται προς την ίδια κατεύθυνση, αφού περισσότερες από 400 πρωτεϊνες μεταβάλουν το ενδοκυττάριο επίπεδο έκφρασής τους (αυξάνοντας ή μειώνοντας την ενδοκυττάρια συγκέντρωσή τους). Ο γονιδιακός αυτός πλουραλισμός αποτελεί ένδειξη της μεγάλης σημασίας του φαινομένου σε μία σειρά φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών, όπως στην εμβρυογένεση , τη νευρωνική διαφοροποίηση, τη γήρανση,  την ανοσολογική απόκριση, τη δημιουργία νευρικών συνάψεων, την ιστική επιδιόρθωση αλλά και σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις (νόσος Alzheimer, νόσος Parkinson, νόσος Huntington, πλάγια αμυοτροφική σκλήρυνση, νωτιαία μυική ατροφία), σε νευροπάθειες (διαβητική νευροπάθεια & αμφιβληστροειδοπάθεια), ακόμα και σε ισχαιμικού τύπου αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια και τραυματισμούς του ΚΝΣ (Πίνακας 3). ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΕΝΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΘΑΝΑΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΡΟΛΟΣ ΡΟΛΟΣ ΣΤΟΝ ΠΚΘ Συνθετάση D προσταγλανδινών Μεταβολισμός εικοσανοειδών Θετική ρύθμιση Αναστολέας των υποδοχέων προσταγλανδίνης F2 Μεταβολισμός εικοσανοειδών Θετική ρύθμιση mGluR 7 Υποδοχείς συζευγμένοι με G-πρωτεϊνες Αρνητική ρύθμιση Edg 5 Υποδοχείς συζευγμένοι με G-πρωτεϊνες Αρνητική ρύθμιση Υποδοχέας κάνναβης 1 Υποδοχείς συζευγμένοι με G-πρωτεϊνες Θετική ρύθμιση Εγκεφαλικό νατριουρητικό πεπτίδιο & ο τύπου 2 υποδοχέας του Μεταγωγή σήματος Θετική ρύθμιση Τύπου Ι υποδοχέας 1,4,5 - τριφωσφορικής ινοσιτόλης Ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος Αρνητική ρύθμιση MAPK & MAPK – φωσφατάσες Ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος Αρνητική ρύθμιση Τύπου ΙΙΙ συνθετάση ΝΟ Ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος Θετική ρύθμιση RhoB Ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος Θετική ρύθμιση Υποδοχείς οικογένειας TGFβ Ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος Θετική ρύθμιση Δίαυλοι Ca2+ Ομοιόσταση ηλεκτρολυτών Θετική ρύθμιση Δίαυλοι Κ+ Ομοιόσταση ηλεκτρολυτών Θετική ρύθμιση ΑΜΡΑ4 – ΝΜDA2c Ρύθμιση διακίνησης ηλεκτρολυτών Θετική ρύθμιση NPX 1 – Νarp Ρύθμιση συναπτικής δραστηριότητας Θετική ρύθμιση PTHrP Ορμόνη Αρνητική ρύθμιση Αδρενομεδουλίνη & ο υποδοχέας της Ορμόνη Αρνητική ρύθμιση Χημειοκίνες της οικογένειας CXC & οι υποδοχείς τους  Ορμόνη Αρνητική ρύθμιση TGFβ2 Ορμόνη Θετική ρύθμιση Νευροτροφίνες 3 & 5 Ορμόνη Αρνητική ρύθμιση BDNF Αυξητικός παράγοντας Αρνητική ρύθμιση ΤD I Μεταβολισμός Τ4 Αρνητική ρύθμιση TD III Μεταβολισμός Τ4 & Τ3 Θετική ρύθμιση Οικογένεια bcl Ρύθμιση απόπτωσης Αρνητική ρύθμιση Οικογένεια κασπασών Ρύθμιση απόπτωσης Θετική ρύθμιση Harakiri Ρύθμιση απόπτωσης Θετική ρύθμιση MEGF1 – FAT2 Διακυτταρική σύνδεση Θετική ρύθμιση Μείζονα συμπλέγματα ιστοσυμβατότητας Διακυτταρική σύνδεση Αρνητική ρύθμιση Ένζυμα μεταβολισμού λιπαρών οξέων Αύξηση ενεργειακής παραγωγής Θετική ρύθμιση Πρωτεϊνες θερμικού shock Αναδίπλωση πρωτεϊνών Θετική ρύθμιση ADP – ριβοσυλοτρανσφεράση Μεταμεταφραστική τροποποίηση Θετική ρύθμιση ADP – ριβοσυλοαργινινο-υδρολάση Μεταμεταφραστική τροποποίηση Αρνητική ρύθμιση Ακετυλοϋδρολάση του PAF Απενεργοποίηση PAF Αρνητική ρύθμιση Πρεσενιλίνη 2 Πρωτεόλυση Θετική ρύθμιση ΠΙΝΑΚΑΣ 3: ΠΑΡΑΤΙΘΕΝΤΑΙ 34 ΑΠΟ ΤΑ ΕΚΑΤΟΝΤΑΔΕΣ ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΧΟΥΝ ΣΤΗ ΔΙΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΠΚΘ, ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΟΙ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΜΕΝΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥΣ. Ο ΟΡΟΣ «ΘΕΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ» ΦΑΝΕΡΩΝΕΙ ΤΗ ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΕΙΤΕ ΣΤΗΝ ΠΡΟΑΓΩΓΗ ΕΙΤΕ ΣΤΗΝ ΔΙΕΚΠΕΡΑΙΩΣΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΠΚΘ, ΕΝΩ Ο ΟΡΟΣ «ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ» ΦΑΝΕΡΩΝΕΙ ΤΗ ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ Η επιστημονική διερεύνηση των πυροδοτικών μηχανισμών του νευρωνικού ΠΚΘ έχει εστιάσει την προσοχή της σε 3 ανεξάρτητες μεταξύ τους καταστάσεις: το οξειδωτικό stress, τη νευρωνική επαναφορά από το στάδιο G0 στο στάδιο G1 του κυτταρικού κύκλου και σε καταστάσεις που προάγουν τα αυξημένα και μειωμένα ενδοκυττάρια επίπεδα ασβεστίου και καλίου αντίστοιχα.  Βέβαια, έχουν διατυπωθεί και υποθέσεις συσχέτισης των παραπάνω καταστάσεων, όπως το ενδεχόμενο της νευρωνικής επαναφοράς από το στάδιο G0 στο στάδιο G1 του κυτταρικού κύκλου σε μία προσπάθεια ιστικής απόκρισης στη βλαπτική επίδραση του οξειδωτικού stress, διαμέσου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η αδυναμία όμως των νευρώνων για διαίρεση, τους οδηγεί στην ενεργοποίηση διαδικασιών απόπτωσης και τελικά στο θάνατο. Εξάλλου, η εργαστηριακή εμπλοκή ελευθέρων ριζών υψηλής ενεργότητας καθώς και ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου ενζύμων σε πειραματικά μοντέλα ΠΚΘ προσανατολίζουν προς αυτή την κατεύθυνση. Οι υποκυτταρικές διεργασίες του ΠΚΘ ακολουθούν, σύμφωνα με τα σημερινά ερευνητικά δεδομένα, 3 βασικά πρότυπα που διέπονται από διαφορές στην μορφολογία του κυτταρικού πυρήνα: τον κλασσικό μηχανισμό της απόπτωσης (που μοριακά αντιστοιχεί σε διανουκλεοσωμικό τεμαχισμό του DNA του πυρήνα), έναν μηχανισμό που μοιάζει με εκείνον της απόπτωσης (με πιο εκτεταμένη κατάτμηση του DNA), καθώς και έναν μηχανισμό που μοιάζει με εκείνους της νέκρωσης (με απουσία κατάτμησης του DNA). Το πρώτο πρότυπο ΠΚΘ περιλαμβάνει, αφενός, την δραστηριοποίηση διαμεμβρανικών υποδοχέων προς την κατεύθυνση της ενεργοποίησης σειράς προενζύμων της οικογένειας των κασπασών, και αφερέρου, την απελευθέρωση κυτοχρώματος c από το ενδομιτοχονδριακό διαμέρισμα στο κυτταρόπλασμα που οδηγεί (συνεργικά μαζί με άλλες πρωτεϊνες) στο σχηματισμό ενός συμπλόκου, του αποπτωσώματος. Το τελικό αποτέλεσμα αφορά στη διαμεσολάβηση για την πυρηνική αποδόμηση της ενεργού μορφής της κασπάσης – 3. Σημαντικό κεφάλαιο στη ρύθμιση της ενεργότητας των κασπασών παίζουν και 2 άλλες οικογένειες μορίων με αντίθετες μεταξύ τους δράσεις: οι αναστολείς της απόπτωσεις (IAP) και οι μιτοχονδριακής προέλευσης ενεργοποιητές των κασπασών (SMAC). Στο δεύτερο πρότυπο ΠΚΘ εμπλέκονται εκ νέου τα μιτοχόνδρια με την απελευθέρωση του παράγοντα επαγωγής της απόπτωσης (AIF), ο οποίος στη συνέχεια μεταφέρεται στον πυρήνα και ρυθμίζει την ενζυμική δράση ενδονουκλεασών. Τέλος, το τρίτο πρότυπο ΠΚΘ εμπεριέχει τη λυσοσωμική αποδόμηση των κυτταρικών οργανιδίων, συμπεριλαμβανομένου και του πυρήνα (αυτοφαγία και παράπτωση). Τα σημαντικότερα υποκυτταρικά φαινόμενα στον ΠΚΘ καθώς και μόρια ή καταστάσεις που εμπλέκονται στη θετική ή αρνητική ρύθμισή τους παρατίθενται στο Σχήμα 1. Η σημασία του ΠΚΘ στη μοριακή παθολογία ενός μεγάλου αριθμού νοσημάτων, καθώς και οι αποκτηθείσες γνώσεις της τελευταίας 20ετίας στο πεδίο της μοριακής φυσιολογίας της απόπτωσης, έχουν στρέψει την προσοχή των ερευνητών στην πειραματική εφαρμογή θεραπευτικών σχημάτων που παρεμβαίνουν στις παραπάνω λειτουργίες. Οι φαρμακολογικές ουσίες που μελετώνται επιδρούν σε μία σειρά υποκυτταρικών επιπέδων, διεγείροντας ή αναστέλλοντας τον ΠΚΘ, ενώ εξετάζεται η συμβολή τους σε μία ποικιλία νοσημάτων, αυτοάνοσης, νευρολογικής, λοιμώδους, τραυματικής ή κακοήθους φύσης, και κάποιες από αυτές έχουν ήδη λάβει έγκριση από τον Οργανισμό Τροφίμων & Φαρμάκων των ΗΠΑ (FDA) (Πίνακας 4). Συμπερασματικά, ο ΠΚΘ αποτελεί μία ιστική αντίδραση, η κατανόηση της οποίας διευρύνει τις γνωσιακές σφαίρες της βιοϊατρικής επιστήμης στο επίπεδο της φυσιολογίας, της παθολογίας και της φαρμακολογίας. Μελλοντικά, είναι αναγκαία η εστίαση των ερευνητικών προσπαθειών τόσο στην κατεύθυνση της πληρέστερης διαλεύκανσης των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον ΠΚΘ και των παθήσεων στις οποίες ο τελευταίος αποτελεί κυρίαρχη συνιστώσα, όσο και στο πεδίο της εκμετάλλευσης της συντελούμενης προόδου στον τομέα της θεραπευτικής. ΣΧΗΜΑ 1 ΟΜΑΔΕΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΤΑΔΙΟ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΔΟΚΙΜΩΝ  Αγωνιστές & ανταγωνιστές υποδοχέων κυτταρικού θανάτου - αντιTNF αντισώματα Κακοήθεις όγκοι Ρευματοειδής αρθρίτιδα Νόσος Crohn Ψωρίαση Αγκυλοποιητική σπονδυλοπάθεια Τραυματισμοί ΝΜ Τα περισσότερα από αυτά τα φάρμακα βρίσκονται σε κλινικό στάδιο δοκιμών, ενώ άλλα έχουν εγκριθεί από τον FDA για χρήση σε ρευματοπάθειες Αναστολείς & ενεργοποιητές κασπασών Ηπατοπάθειες Έμφραγμα μυοκαρδίου Αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο Σηπτικό shock Κακοήθεις όγκοι Ρευματοπάθειες  Νόσος Huntington  Τα περισσότερα από αυτά τα φάρμακα βρίσκονται σε προκλινικό στάδιο δοκιμών, ενώ λίγα έχουν προχωρήσει και σε κλινικό επίπεδο  Αναστολείς & ενεργοποιητές IAP – SMA Κακοήθεις όγκοι Τα περισσότερα από αυτά τα φάρμακα βρίσκονται σε προκλινικό στάδιο δοκιμών, ενώ λίγα έχουν προχωρήσει και σε κλινικό επίπεδο   Αναστολείς & ενεργοποιητές Bcl-2 Κακοήθεις όγκοι Τα περισσότερα από αυτά τα φάρμακα βρίσκονται σε προκλινικό στάδιο δοκιμών, ενώ λίγα έχουν προχωρήσει και σε κλινικό επίπεδο   Αναστολείς & ενεργοποιητές p53  Κακοήθεις όγκοι Τα περισσότερα από αυτά τα φάρμακα βρίσκονται σε προκλινικό στάδιο δοκιμών, ενώ λίγα έχουν προχωρήσει και σε κλινικό επίπεδο ΠΙΝΑΚΑΣ 4 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1.    Marcello D’Amelio, Virve Cavallucci, Adamo Diamantini, Francesco Cecconi, “Analysis of Neuronal Cell Death in Mammals”, Methods in Enzymology, Volume 446 (2008), p. 259 – 276 2.    L. Lossi, C.Cantile, I. Tamagno, A. Merighi,  “Apoptosis in the mammalian CNS: Lessons from animal models”, The Veterinary Journal, 170 (2005), p. 52 – 66  3.    Sebastiano Cavallaro, Velia D’Agata, Enrico Alessi, Salvatore Coffa, Daniel L. Alkon, Pachiappan Manickam, Maria Teresa Ciotti, Roberta Possenti, Paolo Bonini, Lionel Marlier, and Pietro Calissano, “Gene expression profiles of apoptotic neurons”, Genomics, 84 (2004), p. 485 – 496  4.    Oleksandr Ekshyyan, Tak Yee Aw, “Apoptosis in acute and chronic neurological disorders”, Frontiers in Bioscience, 9 (2004), p. 1567 – 1576  5.    Slavica Krantic, Naguib Mechawar, Stephanie Reix, Remi Quirion, “Molecular basis of programmed cell death involved in neurodegeneration”, TRENDS in Neurosciences, Volume 28, No.12 (2005), p. 670 – 676  6.    U. Fischer, K. Schulze – Osthoff, “Apoptosis-based therapies and drug targets”, Cell Death and Differentiation, 12 (2005), p. 942 – 961